紅細(xì)胞壽命測(cè)定與血液病的精準(zhǔn)診斷
發(fā)布時(shí)間：2017-02-04 17:13 作者：無 點(diǎn)擊：
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精準(zhǔn)醫(yī)療的目的是精準(zhǔn)治療，精準(zhǔn)治療的前提是針對(duì)分子靶點(diǎn)的精確診斷分型。目前國(guó)際上白血病診斷通用的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)（Morphology）、免疫學(xué)（Immunology）、細(xì)胞遺傳學(xué)（Cytogenetics）和分子生物學(xué)（Molecular biology）分型，即我們常說的MICM分型方法。
隨著分子診斷技術(shù)的日益發(fā)展和白血病分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，各種先進(jìn)的分子診斷技術(shù)已應(yīng)用于白血病診斷領(lǐng)域，白血病的診斷已從過去以形態(tài)為主的診斷體系，正逐步向以精確分子診斷為核心的個(gè)體化診斷體系發(fā)展。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析和第2代測(cè)序技術(shù)等新的診斷技術(shù)在臨床的推廣應(yīng)用，血液病進(jìn)入一個(gè)精確診斷時(shí)代。這些技術(shù)在白血病的診斷、微小殘留病的監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷及靶向治療等方面發(fā)揮了重要的作用，有些已成為臨床必需的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。正確解讀這些新興的診斷技術(shù)及方法，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理、優(yōu)化及針對(duì)患者量身定做找到每一個(gè)白血病發(fā)病原因及治療方法。
先亞生物科技研發(fā)的紅細(xì)胞壽命測(cè)定儀檢測(cè)的原理
應(yīng)用放射性核素在體內(nèi)或體外標(biāo)記紅細(xì)胞，并觀察這些標(biāo)記的紅細(xì)胞中的放射性消失的速率，從而獲得紅細(xì)胞每天死亡的百分?jǐn)?shù)或稱紅細(xì)胞更新的查分?jǐn)?shù)，則100%更新所需的時(shí)間為紅細(xì)胞壽命期，另外也可利用放射性核素參加紅細(xì)胞生成，測(cè)定放射性在紅細(xì)胞中消失時(shí)間，而求得紅細(xì)胞壽命。目前常用的示蹤劑為51鉻酸鈉及氟32磷酸二異丙酯：用放射性鐵測(cè)定紅細(xì)胞壽命，正常人紅細(xì)胞壽命為100～130天，平均125天左右，此外應(yīng)用51鉻標(biāo)記紅細(xì)胞在循環(huán)血液中減少50%，即T50半衰期作為臨床指標(biāo)，此法較簡(jiǎn)便，正常人為25～40天，20天以下為縮短，17天以下為明顯縮短，溶血性貧血患者紅細(xì)胞壽命明顯縮短，如鐮狀紅細(xì)胞性貧血縮短至5～15天，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）縮短至10天左右。本試驗(yàn)對(duì)研究和診斷溶血性貧血是一個(gè)重要方法，通過分析紅細(xì)胞壽命縮短的原因，可確認(rèn)是由于紅細(xì)胞自身缺陷而致紅細(xì)胞壽命縮短，還是由于患者體內(nèi)某些外界因素而致細(xì)胞壽命縮短，而患者本身紅細(xì)胞是正常的。真性紅細(xì)胞增多癥紅細(xì)胞壽命延長(zhǎng)。
一、 細(xì)胞與分子遺傳學(xué)檢測(cè)
1. 熒光原位雜交（fluorescece in situ hybridization，F(xiàn)ISH）：是臨床上的常規(guī)檢測(cè)方法,是檢測(cè)融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)方法。比常規(guī)的染色體核型分析要方便、準(zhǔn)確和快速，它可檢出一些常規(guī)染色體核型分析不易發(fā)現(xiàn)或有不明來源的標(biāo)志染色體。可檢測(cè)平衡易位和微缺失；用于快速診斷、分類、治療。
2. 多色熒光原位雜交（multiplex-FISH,M-FISH）,多用以確定微小的染色體易位、來源不明的標(biāo)記染色體和隱匿的染色體異位。其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在于可一次性分辨全部人類染色體，適用于復(fù)雜異常核型的診斷、風(fēng)險(xiǎn)分類和預(yù)后判斷，主要用于初發(fā)和復(fù)發(fā)病例的檢測(cè)。但其無法檢測(cè)同一條染色體中的易位或倒位、小片段缺失和重復(fù)等異常，也不能精確地顯示染色體斷裂的區(qū)帶，且靈敏度不及PCR，因此具有一定的局限性。另外，由于費(fèi)用昂貴，目前尚未普及開展。
3. 微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）。在全基因組水平上檢測(cè)白血病基因組DNA序列的拷貝數(shù)變異。有較高的分辨率，可找到染色體核型分析難以發(fā)現(xiàn)的不同染色體上可能的斷裂點(diǎn)和具體的位點(diǎn)。在鑒定慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者微小基因片段重復(fù)或丟失的染色體異常，也可用于與治療相關(guān)AML患者的基因分層。還可以發(fā)現(xiàn)因藥物治療相關(guān)的白血病而導(dǎo)致一些重要微小染色體區(qū)域的異常。因其不能檢測(cè)出平衡易位，且對(duì)于異常細(xì)胞比例少或有丟失片段方面存在漏檢。目前CGH和 aCGH 尚未成為臨床應(yīng)用的常規(guī)檢查之一。
4. SNP芯片：具有高通量性特點(diǎn)，在鑒別白血病是否發(fā)生復(fù)發(fā)突變或克隆演變方面具有較好的臨床價(jià)值；在全基因組水平檢測(cè)與白血病發(fā)生發(fā)展、療效和預(yù)后相關(guān)的SNP位點(diǎn)。目前，已有商業(yè)化SNP芯片供應(yīng)，隨著技術(shù)成熟和檢測(cè)成本下降，SNP芯片將會(huì)成為篩查常規(guī)項(xiàng)目。
二、 微小殘留白血病檢測(cè)
微小殘留白血病（minimal residualdisease，MRD）是白血病復(fù)發(fā)的根源，首選檢測(cè)標(biāo)本為骨髓，其次為外周血。目前已用于檢測(cè)MDR的技術(shù)主要有流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和PCR技術(shù)，PCR技術(shù)是比FCM方法更敏感地檢出MDR，敏感性都可達(dá)到10-5~10-3（即105~103細(xì)胞中有1個(gè)腫瘤細(xì)胞）以上。
1. 多重RT-n-PCR和多重?zé)晒釶CR方法：PCR是檢測(cè)染色體易位的首選方法。二者是臨床上常用的融合基因定性檢測(cè)方法?？赏瑫r(shí)檢測(cè)已知的多種融合基因及剪切體。臨床醫(yī)生可選擇AML 16種常見融合基因、ALL 15種常見融合基因或白血病31種融合基因等組合篩查融合基因。而后者可在熒光定量PCR儀上直接判讀結(jié)結(jié)果。 目前該技術(shù)已逐漸被逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR所取代。
2. 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR （reverse-tranion quantitative real-time PCR，RT-qPCR）：目前已作為檢測(cè)融合基因的常規(guī)方法?；赥aqMan 探針原理的RT-qPCR是目前最為理想的MRD 定量檢測(cè)方法。具有敏感度高、準(zhǔn)確定量、簡(jiǎn)便快速，污染較少等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诎籽〉脑\斷、分型、ＭＲＤ監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。且已有商業(yè)化的試劑盒可利用。有資質(zhì)的醫(yī)療單位或?qū)嶒?yàn)室都能開展此項(xiàng)目。
3. 數(shù)字PCR：是基于單分子PCR方法的核酸靶分子定量檢測(cè)手段，具有高靈敏度的特點(diǎn)。但檢測(cè)成本高，目前還不適合于臨床常規(guī)推廣。
三、 基因突變檢測(cè)
50%以上的白血病缺乏特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)變化，而是是多種基因突變積累的結(jié)果。目前基因突變已作為白血病的更精確地診斷分型、危險(xiǎn)分層，個(gè)體化治療、靶向治療及評(píng)估預(yù)后轉(zhuǎn)歸的主要分子標(biāo)志。例如WHO分類已將AML伴CEBPA突變和AML伴NPM1突變作為一種AML的特殊亞型。白血病較常見突變基因有JAK2、MPL、NPM1、CEBPA、FLT3、C-KIT、N-RAS、WT1、HOX11、ASXL1、DNMT3A、MLL、IDN1、IDH2和TET2等。因此高效、精準(zhǔn)的基因突變篩查方法至關(guān)重要。
1. 直接測(cè)序法（Sanger法）：是基因測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)方法，可分析未知突變。單向測(cè)序讀長(zhǎng)達(dá)500～1000bp, 但只能測(cè)定２０％以上的突變。由于通量小，速度慢，已逐漸被其他高靈敏方法所替代或并用。
2. 焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）：適于已知的短序列的測(cè)序分析，具有可重復(fù)性、快速，能檢測(cè)低至５％的突變及報(bào)告突變頻率。精確性與Sanger相似，適用已知突變位點(diǎn)檢測(cè)，用于白血病的分類和MRD監(jiān)測(cè)。
3. 高通量測(cè)序又名下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）：是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的高通量測(cè)序技術(shù)，是大規(guī)模平行測(cè)序。具有極高靈敏性，可在一個(gè)測(cè)試反應(yīng)中檢測(cè)點(diǎn)突變、缺失、插入、染色體平衡易位及鑒定白血病特異的融合基因等多種異常。其檢測(cè)結(jié)果可以對(duì)臨床醫(yī)生治療方案的制定、患者預(yù)后的評(píng)估提供精準(zhǔn)、有效的信息?？捎糜诨谕蛔儥z測(cè)的MRD分析;也可用于部分白血病發(fā)病機(jī)制的研究。由于費(fèi)用問題，在臨床上尚未大規(guī)模開展。基于大數(shù)據(jù)平臺(tái)的測(cè)序結(jié)果解讀、注釋的合作，可獲得“1+1>2”的成果。隨著檢測(cè)成本的降低，將會(huì)在臨床推廣。
四、 基因表達(dá)譜檢測(cè)
基因表達(dá)譜（gene expression profiling，GEF）：cDNA芯片具有集傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)、點(diǎn)突變分析、基因表達(dá)分析于一身的功能，已經(jīng)用于白血病GEF分析。其優(yōu)越性為能夠在基因表達(dá)水平上對(duì)白血病進(jìn)行更精確的分型分類，從而提高治療的針對(duì)性。預(yù)測(cè)白血病的治療效果和預(yù)后，在探索白血病的病因和機(jī)制診斷、功能相關(guān)基因、新的治療靶基因等方面發(fā)揮重要的作用。不過，敏感度和特異度差，限制其臨床應(yīng)用。
精準(zhǔn)醫(yī)療呼喚著與此相適應(yīng)的精準(zhǔn)診斷，臨床醫(yī)生根據(jù)患者病情，正確評(píng)估形態(tài)學(xué)、免疫、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的作用；合理檢查、精準(zhǔn)診斷及分型、個(gè)體化治療、正確評(píng)估預(yù)后及風(fēng)險(xiǎn)分層，做使患者從精準(zhǔn)醫(yī)療中獲得更多好處。
